Principii și metode de analiză cantitativă prin cromatografie lichidă

Mecanismul de separare al cromatografiei lichide se bazează pe diferența de afinitate a componentelor din amestec pentru cele două faze.

În funcție de diferitele faze staționare, cromatografia lichidă este împărțită în cromatografia lichid-solid, cromatografia lichid-lichid și cromatografia în fază legată.Cele mai utilizate sunt cromatografia lichid-solid cu silicagel ca umplutură și cromatografia în fază legată cu microsilice ca matrice.

În funcție de forma fazei staționare, cromatografia lichidă poate fi împărțită în cromatografia pe coloană, cromatografia pe hârtie și cromatografia în strat subțire.În funcție de capacitatea de adsorbție, acesta poate fi împărțit în cromatografia de adsorbție, cromatografia de partiție, cromatografia de schimb ionic și cromatografia de permeație pe gel.

În ultimii ani, la sistemul de cromatografie pe coloană lichidă a fost adăugat un sistem de curgere a lichidului de înaltă presiune pentru a face faza mobilă să curgă rapid sub presiune înaltă pentru a îmbunătăți efectul de separare, astfel încât cromatografia lichidă de înaltă eficiență (cunoscută și sub numele de presiune înaltă). a apărut.

PARTE
01 Principiul analizei cantitative a cromatografiei lichide

Pentru a cuantifica pe baza calitative, substanțele pure sunt necesare ca standarde;

Cuantificarea prin cromatografie lichidă este o metodă relativ cantitativă: adică cantitatea de analit din amestec este estimată dintr-o cantitate cunoscută de probă standard pură.

PARTE
02 Bazele cuantificării prin cromatografie lichidă

Cantitatea componentei măsurate (W) este proporțională cu valoarea răspunsului (A) (înălțimea vârfului sau zona vârfului), W=f×A.

Factorul de corecție cantitativ (f): Este constanta de proporționalitate a formulei de calcul cantitativ, iar semnificația sa fizică este cantitatea componentei măsurate reprezentată de valoarea răspunsului unitar (aria vârfului).

Factorul de corecție cantitativ poate fi obținut din cantitatea cunoscută de eșantion standard și valoarea de răspuns a acesteia.

Măsurați valoarea de răspuns a componentei necunoscute, iar cantitatea componentei poate fi obținută prin factorul de corecție cantitativă.

PARTE
03 Termeni comuni în analiza cantitativă

Probă (probă): o soluție care conține un analit pentru analiza cromatografică.Împărțit în probe standard și necunoscute.

Standard: Un produs pur cu o concentrație cunoscută.Probă necunoscută (necunoscută): amestecul a cărui concentrație urmează să fie testată.

Greutatea probei: Cântărirea inițială a probei de testat.

Diluție: factorul de diluție al probei necunoscute.

Componentă: vârful cromatografic de analizat cantitativ, adică analitul al cărui conținut este necunoscut.

Cantitatea de component (cantitate): conținutul (sau concentrația) substanței de testat.

Integeritate: Procesul de calcul de măsurare a ariei vârfului unui vârf cromatografic de către un computer.

Curba de calibrare: O curbă liniară a conținutului de componentă față de valoarea răspunsului, stabilită dintr-o cantitate cunoscută de substanță standard, utilizată pentru a determina conținutul necunoscut al analitului.

PARTE
04 Analiza cantitativă a cromatografiei lichide

1. Selectați o metodă cromatografică potrivită pentru analiza cantitativă:

l Confirmați vârful componentei detectate și obțineți o rezoluție (R) mai mare de 1,5

l Determinați consistența (puritatea) vârfurilor cromatografice ale componentelor testate

l Determinați limita de detecție și limita de cuantificare a metodei;sensibilitate și interval liniar

2. Stabiliți o curbă de calibrare cu mostre standard de diferite concentrații

3. Verificați acuratețea și precizia metodelor cantitative

4. Utilizați software-ul corespunzător de management al cromatografiei pentru a implementa colectarea probelor, procesarea datelor și raportarea rezultatelor

PARTE
05 Identificarea vârfurilor cantitative (calitative)

Identificați calitativ fiecare vârf cromatografic de cuantificat

Mai întâi, utilizați proba standard pentru a determina timpul de retenție (Rt) al vârfului cromatografic de cuantificat.Comparând timpul de retenție, găsiți componenta corespunzătoare fiecărui vârf cromatografic din proba necunoscută.Metoda calitativă cromatografică este de a compara timpul de retenție cu proba standard.Criteriul Insuficientconfirmare suplimentară (calitativă)

1. Metoda de adăugare standard

2. Folosiți și alte metode în același timp: alte metode cromatografice (schimbați mecanismul, cum ar fi: folosirea coloanelor cromatografice diferite), alți detectoare (PDA: comparare spectru, căutare bibliotecă de spectru; MS: analiză spectru de masă, căutare bibliotecă de spectru)

3. Alte instrumente și metode

PARTE
06 Confirmarea consistenței vârfului cantitativ

Confirmați consistența vârfului cromatografic (puritatea)

Asigurați-vă că există o singură componentă măsurată sub fiecare vârf cromatografic

Verificați interferența substanțelor coeluate (impurități)

Metode de confirmare a consistenței vârfului cromatografic (puritate)

Compararea spectrogramelor cu detectoare cu matrice fotodiodă (PDA).

Identificarea purității maxime

2996 Teoria unghiului de puritate

Metode cantitative utilizate în mod obișnuit în PARTEA 07

Metoda curbei standard, împărțită în metoda standard externă și metoda standard internă:

1. Metoda standard extern: cel mai utilizat în cromatografia lichidă

O serie de probe standard de concentrații cunoscute au fost preparate folosind probe pure de compuși care urmează să fie testați ca probe standard.injectat în coloană până la valoarea de răspuns (area vârfului).
Într-un anumit interval, există o relație liniară bună între concentrația probei standard și valoarea răspunsului, și anume W= f×A , și se realizează o curbă standard.

În exact aceleași condiții experimentale, injectați proba necunoscută pentru a obține valoarea de răspuns a componentei de măsurat.Conform coeficientului f cunoscut se poate obţine concentraţia componentului de măsurat.

Avantajele metodei standard externe:operare si calcul simpla, este o metoda cantitativa folosita in mod obisnuit;nu este nevoie ca fiecare component să fie detectat și eluat;este necesar un eșantion standard;condițiile de măsurare ale probei standard și ale probei necunoscute ar trebui să fie consecvente;volumul de injectare trebuie să fie precis.

Dezavantajele metodei standard externe:Condițiile experimentale trebuie să fie ridicate, cum ar fi sensibilitatea detectorului, debitul și compoziția fazei mobile nu pot fi modificate;volumul fiecărei injecții trebuie să aibă o repetabilitate bună.

2. Metoda standard intern: precis, dar supărător, cel mai folosit în metodele standard

O cantitate cunoscută de standard intern este adăugată la etalon pentru a face un standard mixt și se prepară o serie de standarde de lucru cu concentrație cunoscută.Raportul molar dintre standard și standard intern în standardul mixt rămâne neschimbat.Se injectează în coloana cromatografică și se ia (zona vârfului eșantionului standard/aria vârfului probei standard internă) ca valoare de răspuns.După relația liniară dintre valoarea răspunsului și concentrația etalonului de lucru, și anume W= f×A , se realizează o curbă standard.

O cantitate cunoscută de standard intern este adăugată la proba necunoscută și injectată în coloană pentru a obține valoarea de răspuns a componentei de măsurat.Conform coeficientului f cunoscut se poate obţine concentraţia componentului de măsurat.

Caracteristicile metodei standard interne:În timpul operațiunii, proba și standardul intern sunt amestecate împreună și injectate în coloana cromatografică, atâta timp cât raportul dintre cantitatea de componentă măsurată și standardul intern din soluția amestecată este constant, modificarea volumului probei. nu va afecta rezultatele cantitative..Metoda standard internă compensează influența volumului probei și chiar faza mobilă și detectorul, astfel încât este mai precisă decât metoda standard extern.

PARTE
08 Factori care afectează rezultatele analizei cantitative

Precizia slabă poate fi cauzată de:

Integrarea incorectă a zonei de vârf, descompunerea probei sau impuritățile introduse în timpul preparării probei, flaconul de probă nesigilat, volatilizarea probei sau a solventului, pregătirea incorectă a probei, probleme de injectare a probei, prepararea incorectă a standardului intern

Motive posibile pentru o precizie slabă:

Integrarea incorectă a vârfurilor, probleme de injecție sau injector, descompunerea probei sau impurități introduse în timpul pregătirii probei, probleme cromatografice, răspuns degradat al detectorului