Cromatografia lichidă este metoda principală de testare a conținutului fiecărei componente și a impurităților din materii prime, intermediari, preparate și materiale de ambalare, dar multe substanțe nu au metode standard pe care să se bazeze, așa că este inevitabil să se dezvolte noi metode. În dezvoltarea metodelor în fază lichidă, coloana cromatografică este nucleul cromatografiei lichide, așa că alegerea unei coloane cromatografice adecvate este crucială. În acest articol, autorul va explica cum să alegeți o coloană de cromatografie lichidă din trei aspecte: idei generale, considerații și domeniul de aplicare.
A. Idei generale pentru selectarea coloanelor de cromatografie lichidă
1. Evaluați proprietățile fizice și chimice ale analitului: cum ar fi structura chimică, solubilitatea, stabilitatea (cum ar fi dacă este ușor de oxidat/redus/hidrolizat), aciditatea și alcalinitatea etc., în special structura chimică este cheia factor în determinarea proprietăților, cum ar fi grupul conjugat are o absorbție puternică de ultraviolete și fluorescență puternică;
2. Determinați scopul analizei: dacă sunt necesare separare mare, eficiență ridicată a coloanei, timp scurt de analiză, sensibilitate ridicată, rezistență la presiune ridicată, durată lungă de viață a coloanei, cost redus etc.;
- Alegeți o coloană cromatografică adecvată: înțelegeți compoziția, proprietățile fizice și chimice ale umpluturii cromatografice, cum ar fi dimensiunea particulelor, dimensiunea porilor, toleranța la temperatură, toleranța pH-ului, adsorbția analitului etc.
- Considerații pentru selectarea coloanelor de cromatografie lichidă
Acest capitol va discuta factorii care trebuie luați în considerare la selectarea unei coloane de cromatografie din perspectiva proprietăților fizice și chimice ale coloanei de cromatografie în sine. 2.1 Matricea de umplere
2.1.1 Matricea cu silicagel Matricea de umplutură a majorității coloanelor de cromatografie lichidă este silicagel. Acest tip de umplutură are puritate ridicată, cost redus, rezistență mecanică ridicată și este ușor de modificat grupări (cum ar fi legăturile fenil, legăturile amino, legăturile ciano etc.), dar valoarea pH-ului și intervalul de temperatură pe care le tolerează sunt limitate: Intervalul de pH al majorității materialelor de umplutură cu matrice de silicagel este de la 2 la 8, dar intervalul de pH al fazelor de silicagel special modificate poate fi de la 1,5 la 10 și există, de asemenea, faze de silicagel special modificate, care sunt stabile la pH scăzut, cum ar fi Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, care este stabil la pH 1 până la 8; limita superioară de temperatură a matricei de silicagel este de obicei de 60 ℃, iar unele coloane de cromatografie pot tolera o temperatură de 40 ℃ la pH ridicat.
2.1.2 Matricea polimerică Umpluturile polimerice sunt în mare parte polistiren-divinilbenzen sau polimetacrilat. Avantajele lor sunt că pot tolera o gamă largă de pH – pot fi utilizate în intervalul de la 1 la 14 și sunt mai rezistente la temperaturi ridicate (pot ajunge la peste 80 °C). În comparație cu materiale de umplutură C18 pe bază de silice, acest tip de umplutură are o hidrofobie mai puternică, iar polimerul macroporos este foarte eficient în separarea probelor, cum ar fi proteinele. Dezavantajele sale sunt că eficiența coloanei este mai mică și rezistența mecanică este mai slabă decât cea a materialelor de umplutură pe bază de silice. 2.2 Forma particulelor
Majoritatea materialelor de umplutură HPLC moderne sunt particule sferice, dar uneori sunt particule neregulate. Particulele sferice pot oferi o presiune mai mică a coloanei, o eficiență mai mare a coloanei, stabilitate și o viață mai lungă; atunci când se utilizează faze mobile cu vâscozitate ridicată (cum ar fi acidul fosforic) sau când soluția de probă este vâscoasă, particulele neregulate au o suprafață specifică mai mare, ceea ce este mai propice pentru acțiunea deplină a celor două faze, iar prețul este relativ scăzut. 2.3 Dimensiunea particulelor
Cu cât dimensiunea particulelor este mai mică, cu atât eficiența coloanei este mai mare și separarea este mai mare, dar cu atât rezistența la presiune înaltă este mai slabă. Coloana cel mai frecvent utilizată este coloana cu dimensiunea particulelor de 5 μm; dacă cerințele de separare sunt mari, poate fi selectat un material de umplutură de 1,5-3 μm, ceea ce este favorabil pentru rezolvarea problemei de separare a unor probe complexe cu matrice și mai multe componente. UPLC poate folosi umpluturi de 1,5 μm; Materialele de umplutură cu dimensiunea particulelor de 10 μm sau mai mari sunt adesea folosite pentru coloanele semipreparative sau preparative. 2.4 Conținutul de carbon
Conținutul de carbon se referă la proporția fazei lipite pe suprafața gelului de silice, care este legată de suprafața specifică și de acoperirea fazei lipite. Conținutul ridicat de carbon asigură o capacitate mare a coloanei și o rezoluție ridicată și este adesea folosit pentru probe complexe care necesită o separare mare, dar datorită timpului lung de interacțiune dintre cele două faze, timpul de analiză este lung; Coloanele cromatografice cu conținut scăzut de carbon au un timp de analiză mai scurt și pot prezenta selectivități diferite și sunt adesea folosite pentru probe simple care necesită analiză rapidă și probe care necesită condiții de fază apoasă ridicată. În general, conținutul de carbon al C18 variază de la 7% la 19%. 2.5 Dimensiunea porilor și suprafața specifică
Mediile de adsorbție HPLC sunt particule poroase și majoritatea interacțiunilor au loc în pori. Prin urmare, moleculele trebuie să intre în pori pentru a fi adsorbite și separate.
Dimensiunea porilor și suprafața specifică sunt două concepte complementare. Dimensiunea mică a porilor înseamnă o suprafață specifică mare și invers. O suprafață specifică mare poate crește interacțiunea dintre moleculele probei și fazele legate, poate îmbunătăți retenția, crește încărcarea probei și capacitatea coloanei și separarea componentelor complexe. Materialele de umplutură complet poroase aparțin acestui tip de umpluturi. Pentru cei cu cerințe mari de separare, se recomandă alegerea materialelor de umplutură cu suprafață specifică mare; O suprafață specifică mică poate reduce contrapresiunea, poate îmbunătăți eficiența coloanei și poate reduce timpul de echilibru, care este potrivit pentru analiza gradientului. Materialele de umplutură miez-înveliș aparțin acestui tip de umpluturi. Pe premisa asigurării separării, se recomandă alegerea materialelor de umplutură cu suprafață specifică mică pentru cei cu cerințe ridicate de eficiență a analizei. 2.6 Volumul porilor și rezistența mecanică
Volumul porilor, cunoscut și sub numele de „volumul porilor”, se referă la dimensiunea volumului gol pe unitate de particule. Poate reflecta bine rezistența mecanică a umpluturii. Rezistența mecanică a materialelor de umplutură cu volum mare de pori este puțin mai slabă decât cea a materialelor de umplutură cu volum mic de pori. Umpluturi cu volum de pori mai mic sau egal cu 1,5 ml/g sunt utilizate în principal pentru separarea HPLC, în timp ce materiale de umplutură cu volum de pori mai mare de 1,5 ml/g sunt utilizate în principal pentru cromatografia de excludere moleculară și cromatografia la presiune joasă. 2.7 Rata de plafonare
Limitarea poate reduce vârfurile de decantare cauzate de interacțiunea dintre compuși și grupările silanol expuse (cum ar fi legătura ionică între compușii alcalini și grupările silanol, forțele van der Waals și legăturile de hidrogen între compușii acizi și grupările silanol), îmbunătățind astfel eficiența coloanei și forma vârfului. . Fazele legate nelimitate vor produce selectivități diferite în raport cu fazele legate cu capac, în special pentru probele polare.
- Domeniul de aplicare al diferitelor coloane de cromatografie lichidă
Acest capitol va descrie domeniul de aplicare al diferitelor tipuri de coloane de cromatografie lichidă în unele cazuri.
3.1 Coloană cromatografică C18 cu fază inversă
Coloana C18 este cea mai utilizată coloană cu fază inversă, care poate îndeplini testele de conținut și impurități ale majorității substanțelor organice și este aplicabilă substanțelor cu polaritate medie, slab polar și nepolar. Tipul și specificațiile coloanei cromatografice C18 trebuie selectate în funcție de cerințele specifice de separare. De exemplu, pentru substanțele cu cerințe mari de separare, sunt adesea utilizate specificații de 5 μm*4,6 mm*250 mm; pentru substanțele cu matrice de separare complexe și polaritate similară, pot fi utilizate specificații de 4 μm*4,6 mm*250 mm sau dimensiuni mai mici ale particulelor. De exemplu, autorul a folosit o coloană de 3 μm * 4,6 mm * 250 mm pentru a detecta două impurități genotoxice în celecoxib API. Separarea celor două substanțe poate ajunge la 2,9, ceea ce este excelent. În plus, sub premisa asigurării separării, dacă este necesară o analiză rapidă, este adesea selectată o coloană scurtă de 10 mm sau 15 mm. De exemplu, când autorul a folosit LC-MS/MS pentru a detecta o impuritate genotoxică în API de fosfat de piperachină, a fost folosită o coloană de 3 μm * 2,1 mm * 100 mm. Separarea dintre impuritate și componenta principală a fost de 2,0, iar detectarea unei probe poate fi finalizată în 5 minute. 3.2 Coloană fenil cu fază inversă
Coloana fenil este, de asemenea, un tip de coloană cu fază inversă. Acest tip de coloană are o selectivitate puternică pentru compușii aromatici. Dacă răspunsul compușilor aromatici măsurați prin coloana C18 obișnuită este slab, puteți lua în considerare înlocuirea coloanei cu fenil. De exemplu, când făceam celecoxib API, răspunsul componentei principale măsurat de coloana de fenil a aceluiași producător și aceeași specificație (toate 5 μm * 4,6 mm * 250 mm) a fost de aproximativ 7 ori mai mare decât coloana C18. 3.3 Coloana în fază normală
Ca un supliment eficient pentru coloana cu fază inversă, coloana cu fază normală este potrivită pentru compușii extrem de polari. Dacă vârful este încă foarte rapid la eluare cu mai mult de 90% fază apoasă în coloana cu fază inversă și chiar aproape și se suprapune cu vârful solventului, puteți lua în considerare înlocuirea coloanei în fază normală. Acest tip de coloană include coloana hilică, coloana amino, coloana ciano etc.
3.3.1 Coloana hilică Coloana hilică înglobează de obicei grupări hidrofile în lanțul alchil legat pentru a îmbunătăți răspunsul la substanțele polare. Acest tip de coloană este potrivit pentru analiza substanțelor zaharoase. Autorul a folosit acest tip de coloană atunci când a făcut conținutul și substanțele înrudite ale xilozei și derivaților acesteia. Izomerii unui derivat de xiloză pot fi de asemenea bine separați;
3.3.2 Coloana amino și coloana ciano Coloana Amino și coloana ciano se referă la introducerea modificărilor amino și ciano la sfârșitul lanțului alchil legat, respectiv, pentru a îmbunătăți selectivitatea pentru substanțe speciale: de exemplu, coloana amino este o alegere bună pentru separarea zaharurilor, aminoacizilor, bazelor și amidelor; Coloana ciano are o selectivitate mai bună la separarea substanțelor similare structurale hidrogenate și nehidrogenate datorită prezenței legăturilor conjugate. Coloana amino și coloana ciano pot fi adesea comutate între coloana cu fază normală și coloana cu fază inversă, dar comutarea frecventă nu este recomandată. 3.4 Coloana chirală
Coloana chirală, după cum sugerează și numele, este potrivită pentru separarea și analiza compușilor chirali, în special în domeniul farmaceutic. Acest tip de coloană poate fi luat în considerare atunci când coloanele convenționale cu fază inversă și fază normală nu pot realiza separarea izomerilor. De exemplu, autorul a folosit o coloană chirală de 5 μm*4,6 mm*250 mm pentru a separa cei doi izomeri ai 1,2-difeniletilendiaminei: (1S, 2S)-1, 2-difeniletilendiamină și (1R, 2R)-1, 2 -difeniletilendiamină, iar separarea dintre cele două a ajuns la aproximativ 2,0. Cu toate acestea, coloanele chirale sunt mai scumpe decât alte tipuri de coloane, de obicei 1W+/buc. Dacă este nevoie de astfel de coloane, unitatea trebuie să facă un buget suficient. 3.5 Coloana schimbătoare de ioni
Coloanele schimbătoare de ioni sunt potrivite pentru separarea și analiza ionilor încărcați, cum ar fi ionii, proteinele, acizii nucleici și unele substanțe zaharoase. În funcție de tipul de umplutură, acestea sunt împărțite în coloane cu schimb de cationi, coloane cu schimb de anioni și coloane cu schimb de cationi puternice.
Coloanele schimbătoare de cationi includ coloane pe bază de calciu și hidrogen, care sunt potrivite în principal pentru analiza substanțelor cationice, cum ar fi aminoacizii. De exemplu, autorul a folosit coloane pe bază de calciu atunci când a analizat gluconat de calciu și acetat de calciu într-o soluție de spălare. Ambele substanțe au avut răspunsuri puternice la λ=210nm, iar gradul de separare a ajuns la 3,0; autorul a folosit coloane pe bază de hidrogen atunci când a analizat substanțele înrudite cu glucoză. Câteva substanțe majore înrudite – maltoză, maltotrioză și fructoză – au avut sensibilitate ridicată la detectoare diferențiale, cu o limită de detecție de până la 0,5 ppm și un grad de separare de 2,0-2,5.
Coloanele schimbătoare de anioni sunt potrivite în principal pentru analiza substanțelor anionice, cum ar fi acizii organici și ionii de halogen; coloanele puternice de schimb de cationi au o capacitate și selectivitate mai mare de schimb de ioni și sunt potrivite pentru separarea și analiza probelor complexe.
Cele de mai sus sunt doar o introducere în tipurile și domeniile de aplicare ale mai multor coloane de cromatografie lichidă obișnuite, combinate cu propria experiență a autorului. Există și alte tipuri speciale de coloane cromatografice în aplicații reale, cum ar fi coloane cromatografice cu pori mari, coloane cromatografice cu pori mici, coloane pentru cromatografie de afinitate, coloane cromatografice multimodale, coloane pentru cromatografie lichidă de performanță ultra-înaltă (UHPLC), coloane pentru cromatografie fluidă supercritică ( SFC), etc. Ele joacă un rol important în diferite domenii. Tipul specific de coloană cromatografică trebuie selectat în funcție de structura și proprietățile probei, cerințele de separare și alte scopuri.
Ora postării: 14-jun-2024