Faza mobilă este echivalentă cu faza lichidă a sângelui, și există diverse lucruri la care să acordați atenție în timpul utilizării. Printre acestea, există câteva „capcane” cărora trebuie să li se acorde atenție.
01. Măsurați pH-ul fazei mobile după adăugarea solventului organic
Dacă măsurați pH-ul cu un aditiv organic, pH-ul pe care îl obțineți va fi diferit decât înainte de adăugarea solventului organic. Cu toate acestea, cel mai important lucru este să fii consecvent. Dacă măsurați întotdeauna pH-ul după adăugarea solventului organic, asigurați-vă că vă indicați pașii în metoda pe care o utilizați, astfel încât alții să urmeze aceeași metodă. Această metodă nu este 100% precisă, dar cel puțin va menține metoda consistentă. Acest lucru poate fi mai important decât obținerea unei valori precise a pH-ului.
02. Nu este folosit niciun tampon
Scopul unui tampon este de a controla pH-ul și de a preveni modificarea acestuia. Multe alte metode modifică pH-ul fazei mobile, ceea ce poate cauza schimbări în timpul de retenție, forma vârfului și răspunsul maxim.
Acidul formic, TFA etc. nu sunt tampon
03. Nu se utilizează tampon în intervalul normal de pH
Fiecare tampon are o lățime de interval de 2 unități de pH, în care oferă cea mai bună stabilitate a pH-ului. Tampoanele din afara acestei ferestre nu vor oferi rezistență eficientă la modificările pH-ului. Fie utilizați un tampon în intervalul corect, fie alegeți un tampon care acoperă intervalul de pH de care aveți nevoie.
04. Adăugați tampon la soluția organică
Amestecarea unei soluții tampon cu o fază organică va determina, cel mai probabil, precipitarea tamponului. În multe cazuri, chiar dacă au apărut precipitații, este încă dificil de detectat. Nu uitați să adăugați întotdeauna soluția organică în faza apoasă, ceea ce poate reduce foarte mult șansa de precipitare a tamponului.
05. Se amestecă gradientul de concentrație de la 0% cu o pompă
Pompele disponibile astăzi pot amesteca în mod eficient fazele mobile și degazează în linie, dar nu toți cei care folosesc metoda dvs. vor avea o pompă de înaltă calitate. Amestecați A și B într-o singură soluție și rulați-o 100% în linie.
De exemplu, 950 ml de amestec organic de pornire pot fi preparate prin amestecare cu 50 ml de apă. Avantajul acestui lucru este că poate reduce variabilitatea dintre HPLC și poate reduce posibilitatea de bule și precipitații în sistem. Este de remarcat faptul că raportul amestecului de pompă este de 95:5, ceea ce nu înseamnă că timpul de retenție pre-amestecat în sticlă este de asemenea 95:5.
06. Nu se utilizează acidul (baza) corect modificat pentru a schimba tamponul
Utilizați numai acidul sau baza care formează sarea tampon pe care o utilizați. De exemplu, un tampon fosfat de sodiu trebuie preparat numai cu acid fosforic sau hidroxid de sodiu.
07. Nu se menționează toate informațiile despre tampon în metodă, cum ar fi adăugarea a 5g defosfat de sodiu la 1000 ml de apă.
Tipul de tampon determină domeniul de pH care poate fi tamponat. Concentrația necesară determină puterea tamponului. 5 grame sau fosfat de sodiu anhidru și 5 grame de fosfat monosodic monohidrat au puteri tampon diferite.
08. Adăugarea solvenților organici înainte de verificare
Dacă metoda anterioară a folosit o soluție tampon pentru linia de bază B, iar metoda dvs. folosește o soluție organică pentru linia de bază B, sperăm că puteți așeza tamponul în tubul și capul pompei.
09. Ridicați sticla și goliți ultima picătură
Există șanse mari să nu aveți suficientă fază mobilă pentru a finaliza întreaga rulare și proba dvs. va fuma. Pe lângă posibilitatea de ardere a sistemului de pompare și a coloanei, faza mobilă se va evapora complet, iar faza mobilă din partea superioară a sticlei se va schimba.
10. Utilizați faza mobilă de degazare cu ultrasunete
Cel mai important punct este să vă asigurați că toate sărurile tampon sunt dizolvate, dar aceasta este cea mai proastă modalitate de degazare și va încălzi rapid faza mobilă, determinând evaporarea componentelor organice. Pentru a economisi probleme inutile mai târziu, luați cinci minute pentru a vă filtra cu vid faza mobilă.
Ora postării: 27-aug-2024